尽管肿瘤靶向治疗已取得进展
，但致癌性KRAS仍是肺腺癌治疗中的主要挑战。临床实践中
，KRASG12C抑制剂缓解率有限且常伴随获得性耐药。铜死亡是近期发现的一种铜介导的细胞死亡形式
，先前研究表明铜代谢在KRAS驱动肿瘤的发展中扮演重要角色。

本文分享一篇发表在Cancer Research期刊上的文章
，题为：Targeting ATP7A-Dependent Copper Metabolic Homeostasis Induces Cuproptosis and Suppresses the Progression of Mutant KRAS-Driven Lung Cancer
，揭示了KRAS G12驱动的肺腺癌依赖于ATP7A介导的铜代谢稳态
，而铜离子载体elesclomol (ES)可通过干扰此稳态作为一种有效的治疗策略。

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，分别靶向ATP7A、OSTM1和Ostm1基因
，用于感染人肺癌细胞和小鼠肺癌类器官。

·研究背景·

肺癌是中国发病率和死亡率最高的高度恶性肿瘤。研究聚焦于携带KRAS基因突变的肺腺癌
，这是一个临床治疗难题。尽管已有靶向药物（如索托拉西布）
，但存在应答率低和易产生耐药的局限。近年来
，一种名为铜死亡的新型细胞死亡方式被发现
，且研究表明铜代谢与KRAS驱动的肿瘤进展密切相关。这提示靶向铜代谢可能成为治疗KRAS突变肺癌的新思路。其中
，铜输出蛋白ATP7A是维持癌细胞铜稳态的关键
，ATP7A为内质网跨膜蛋白
，可转位至质膜
，介导铜输出并防止铜毒性。先前研究表明铜离子载体药物ES可能通过泛素化途径降解ATP7A从而发挥作用
，但其具体机制不明。本研究旨在探讨针对KRAS G12突变肺腺癌细胞铜代谢稳态的治疗潜力及其分子机制。

·研究结果·

1.靶向肺腺癌细胞的高铜环境以诱导铜死亡

为确定在肺腺癌治疗中诱导铜死亡的可行性
，作者分析了肺腺癌患者血清和胸水中的铜浓度。临床样本数据证实LUAD患者血清和恶性胸水中铜浓度显著升高
，且铜浓度与肿瘤增殖活性（Ki67）正相关（图1A-C）。进一步结果表明
，ES在肺腺癌细胞中诱导的是铜依赖性细胞死亡
，而非其他金属离子（Fe??、Co?? 和 Ni??
，100 nM）所致。

接着作者使用铜离子载体ES联合Cu（ES+Cu）处理LUAD细胞（如A549, H358）
，发现ES+Cu能特异性增加LUAD细胞内铜负载
，持续抑制细胞活力并降低增殖能力。进一步的分析发现ES+Cu对细胞毒性可能并非通过凋亡通路介导
，作者检测了cleaved-PARP的表达
，结果显示ES+Cu脉冲并未引起cleaved-PARP的上调
，且ES+Cu介导的细胞死亡不能被其他细胞死亡抑制剂逆转
，但可被铜离子螯合剂四硫钼酸铵（TTM）逆转。这些结果表明
，靶向铜代谢诱导铜死亡可能是肺腺癌治疗的一种策略。

2.ES通过干扰线粒体能量代谢抑制肺腺癌细胞增殖

为验证ES对肺腺癌细胞的抑制作用
，作者分析了其对生物学功能的影响。结果显示ES+Cu脉冲处理降低了A549细胞活力并诱导细胞质空泡化
，而单独的ES或CuCl?则不能。并且ES+Cu处理能够下调铜死亡指标FDX1
，显著抑制细胞克隆形成（图1D）。随后
，作者检测了细胞内氧化应激水平
，ES+Cu（100 nM, 1:1）处理2小时后
，细胞活性氧水平升高（图1E）。此外
，ES+Cu脉冲诱导了TCA循环中重要调控蛋白DLAT的寡聚化（图1F）。线粒体压力测试显示
，ES+Cu脉冲影响了肺腺癌细胞的最大呼吸和备用呼吸能力
，但对ATP产生或基础呼吸无显著影响（图1G-I）。总之
，ES通过干扰线粒体功能抑制了肺腺癌细胞的增殖。

图1 靶向铜代谢可抑制LUAD 细胞

3.KRAS突变细胞中ATP7A依赖的铜稳态

为了分析肺腺癌细胞对ES+Cu的敏感性
，作者测定了多种肺腺癌细胞和人支气管上皮细胞中ES+Cu的IC??
，有趣的是
，与KRAS G12野生型肺腺癌细胞相比
，KRAS G12突变肺腺癌细胞似乎对ES+Cu处理更敏感（图2A）。然而
，KRAS G12突变肺腺癌患者的血清和胸腔积液铜浓度显著高于KRAS G12野生型患者（附图S3D）。这一现象提示
，ES可能通过靶向活跃的铜代谢来杀死KRAS G12突变肺腺癌细胞。随后作者发现CuCl? 能够促进LUAD 细胞的增殖
，但联合ES后促进作用转变成了毒性效应。此外作者发现在H838（KRAS G12野生型）细胞中
，对外源铜毒性的耐受性低于A549（KRAS G12突变）细胞
，但对ES+Cu处理的耐受性更高
，这表明ES可能通过调控某些关键的铜代谢相关蛋白来实现对KRAS G12突变肺腺癌细胞的特异性杀伤。

为了阐明其机制
，作者首先分析了CCLE数据库中铜转运相关基因表达与KRAS G12突变状态的相关性。结果显示
，在KRAS G12突变肺腺癌细胞中
，铜输出蛋白ATP7A的表达上调
，而铜伴侣蛋白CCS的表达下调
，表明细胞内铜离子水平升高（图2B）。并且IHC和WB分析表明
，KRAS G12突变患者的ATP7A表达显著高于KRAS G12野生型患者（图2C-D）
，KRAS G12突变细胞中ATP7A的蛋白表达高于KRAS G12野生型细胞
，而CCS蛋白在KRAS G12突变细胞中表达水平较低（图2E）。作者进一步将KRAS突变质粒转染到HEK 293T细胞后
，观察到ATP7A蛋白表达显著增加（图2F-G）。随后
，作者进一步分析了ES是否通过调节铜稳态来影响ATP7A的表达并抑制KRAS G12突变肺腺癌细胞的活性。CCK-8实验表明
，在外源铜补充存在下
，ES能杀死细胞（图2H）。Western印迹结果显示
，在外源铜补充存在下
，ES降解了ATP7A（图2I）；谡庑┙峁
，作者推测KRAS突变细胞可能依赖高ATP7A表达来维持细胞内铜稳态
，而ES+Cu处理可通过降解ATP7A来诱导对KRAS突变细胞的靶向抑制。

为验证此假设
，作者对A549和H358细胞进行了ATP7A敲低
，发现ATP7A敲低细胞在CuCl?处理后细胞活力显著下降
，而TTM可；は赴馐芄客拘。作者进一步构建了ATP7A敲除细胞模型
，发现ATP7A敲除细胞对外源铜离子毒性的耐受性显著降低。同时作者也比较了在相似的ATP7A敲低效率下铜对H838细胞（KRAS G12野生型）的毒性
，发现外源铜对A549细胞的毒性强于对H838细胞的毒性。进一步的实验证据表明
，在肺腺癌细胞中
，CuCl?在低浓度时表现出促进细胞增殖的效应
，在高浓度时则抑制细胞增殖。此外
，此效应与KRAS突变状态密切相关。具体而言
，与KRAS野生型肺腺癌细胞相比
，KRAS突变肺腺癌细胞的适应浓度范围更宽
，表明其对铜的需求增加且对铜毒性耐受性增强
，这与更高的ATP7A表达水平一致。总之
，这些结果表明ATP7A在维持KRAS G12突变细胞的铜稳态中起重要作用
，ES可能通过调控ATP7A的表达对KRAS G12突变细胞发挥靶向抑制作用。

图2 KRASG12突变LUAD细胞对ES介导的铜死亡敏感

4.ES+Cu在体内发挥抗肿瘤作用

为阐明ES+Cu对肺腺癌的体内抗肿瘤作用
，作者进行了BALB/c裸鼠荷瘤实验
，分析结果显示：ES+Cu处理抑制了肿瘤体积、生长和重量（图3B-D）。此外
，IHC 染色结果表明：ES+Cu处理后ATP7A和FDX1的蛋白水平下降
，而HSP70的蛋白水平升高
，表明ES+Cu可在体内诱导铜死亡
，且ES+Cu诱导的内质网应激与ATP7A蛋白的下调相关（图3F-G）。总之
，体内生长实验表明
，ES+Cu通过在体内激活铜死亡和内质网应激介导的ATP7A降解来抑制肿瘤增殖。

图3 ES+Cu在体内能显著抑制异种移植瘤的生长

5.ES+Cu通过泛素化途径促进ATP7A降解

为验证ES+Cu是否通过调控ATP7A来影响细胞铜代谢
，作者分析了ES+Cu对ATP7A表达的影响。首先
，ES+Cu处理以时间依赖性方式显著诱导了ATP7A的降解（图4A-B）
，但并未显著影响ATP7A的mRNA表达（图4C）
，表明ES+Cu可能通过转录后调控影响ATP7A的表达。富集分析结果显示：ES+Cu脉冲处理导致H358细胞中泛素化相关通路显著激活（图4D）。作者使用CHX（放线菌酮）处理A549和H358细胞
，检测了ATP7A蛋白的降解（图4E-F）
，发现ES+Cu处理显著缩短了ATP7A蛋白的半衰期
，而MG132处理逆转了此缩短效应
，表明ES+Cu通过泛素化途径介导ATP7A的降解（图4G）。免疫共沉淀实验也证实
，ES+Cu（50 nM, 1:1, 6 h）可导致A549和H358细胞中ATP7A泛素化显著增加（图4H）。此外
，作者发现ES+Cu（50 nM, 1:1, 6 h）处理促进了ATP7A蛋白上Lys48（K48）连接的多聚泛素链形成
，而非Lys63（K63）连接链
，这支持了蛋白酶体介导的底物降解（图4I）。上述结果揭示了ES+Cu通过泛素化途径促进ATP7A降解。

图4 ES+Cu诱导的ATP7A降解与泛素化修饰有关

6.OSTM1是介导ATP7A降解的E3连接酶

为鉴定介导ATP7A泛素化降解的E3连接酶
，作者分析了经ES+Cu处理上调但经TTM处理下调的基因
，发现OSTM1受ES介导的铜内流调控
，并可能与ATP7A相互作用。接着作者通过分子动力学对接来验证OSTM1是否能与ATP7A相互作用
，结果发现两者存在多个位点相互作用
，且ATP7A的E513位于潜在的识别基序序列IRGY内
，提示该位点可能是ATP7A与OSTM1的结合位点。随后作者使用IgG/ATP7A抗体对A549和H358细胞进行免疫共沉淀
，结果表明：A549和H358细胞中的内源性OSTM1可与ATP7A蛋白结合。

接着作者构建了OSTM1敲低肺腺癌细胞（图5A）
，发现OSTM1敲低对ATP7A的mRNA表达水平无显著影响（图5B）
，但显著延长了ATP7A蛋白的半衰期
，进一步证实了OSTM1对ATP7A的翻译后调控作用（图5C-E）
，免疫共沉淀实验也证实OSTM1敲低导致ATP7A泛素化显著降低（图5F）。先前研究指出OSTM1是一种E3泛素连接酶
，受E1连接酶UBA1和E2连接酶UBE2D2调控
，可介导底物的泛素化修饰及随后的降解
，作者将UBA1、UBE2D2和OSTM1质粒转染到HEK 293T细胞中
，观察到ATP7A的泛素化修饰水平显著增加
，提示了UBA1-UBE2D2-OSTM1-ATP7A这一泛素化修饰系统（图5G）。此外
，当OSTM1被敲除时
，ES+Cu脉冲诱导的ATP7A泛素化增强被显著减弱
，表明OSTM1对ATP7A的泛素化修饰是ES降解ATP7A的重要介导因素（图5H）。

为验证OSTM1与ATP7A之间的特异性结合区域
，作者构建了靶向ATP7A IRGY基序的肽段
，以竞争性结合IRGY基序。免疫共沉淀实验显示
，靶向IRGY基序的肽段抑制了OSTM1与ATP7A的结合（图5I）。此外
，体外泛素化实验证实OSTM1是ATP7A的E3连接酶（图5J）。这些结果表明OSTM1可作为介导ATP7A泛素化降解的E3连接酶。

图5 E3泛素连接酶OSTM1可调控ATP7A的泛素化和降解

7.体内ES+Cu治疗实验

为在体内进一步验证ES+Cu的抗肿瘤活性
，作者通过杂交CC10-rtTA/TetO-Cre和LSL-KRAS G12D小鼠
，构建了CC10-rtTA/TetO-Cre/LSL-KRAS G12D条件性突变小鼠(图6A)
，并通过DOX 处理8周获得肺腺癌结节模型小鼠。与先前结果一致（图1A）
，KRAS G12D诱导的肺腺癌组的血清铜浓度显著高于对照组（P<0.001
，图6D）。IHC分析表明
，在KRAS G12D诱导的肺腺癌结节中ATP7A蛋白表达上调
，提示KRAS G12D突变与ATP7A表达相关（图6E）。相反
，在KRAS G12D诱导的肺腺癌结节中观察到E3连接酶OSTM1下调（图6F）。

接着作者把小鼠分成两组
，一组给予常规饮用水
，另一组给予20 mg/L CuCl?的饮用水（图6G）
，结果发现补充过量CuCl?的小鼠肺部病变更严重
，表明铜对肺腺癌进展有促进作用（图6H-I）。进一步
，作者分析了ES+Cu治疗在CC10-rtTA/TetO-Cre/LSL-KRAS G12D转基因小鼠中的体内效应（图6J）。治疗2周后
，ES+Cu处理组小鼠的肺部病变显著轻于对照组（图6K-L）。荧光免疫组化分析表明
，ES+Cu处理后OSTM1蛋白上调
，而ATP7A蛋白下调（附图S6B）。此外
，移植瘤实验证实
，敲除OSTM1可部分逆转ES+Cu介导的体内肿瘤抑制活性
，提示OSTM1是ES+Cu介导的体内抗肿瘤活性的重要中间因子（附图S6C-F）。Western印迹实验证实
，敲除OSTM1削弱了ES+Cu对ATP7A的降解效应
，进一步证实了ES+Cu/OSTM1/ATP7A这一抗肿瘤调控轴（附图S6G-H）。这些结果阐明了ES+Cu通过上调OSTM1介导ATP7A蛋白的泛素化降解来发挥体内治疗作用。

图6 转基因小鼠模型证实ES+Cu可治疗KRASG12D驱动的LUAD

8.建立CC10-rtTA/TetO-Cre/LSL-KRAS G12D转基因小鼠衍生的LCOs

为进一步验证ES+Cu的治疗效果
，作者收集了CC10-rtTA/TetO-Cre/LSL-KRAS G12D条件性小鼠的原位肺腺癌组织
，并建立了用于长期培养的LCOs（图7A）。为验证ES+Cu对LCOs的治疗效果
，用ES+Cu处理LCOs指定时间。形态学观察显示
，随着ES+Cu处理
，LCOs出现边界破裂和空泡出现（图7D）；盍Ψ治霰砻
，ES+Cu处理后LCOs的相对活力被显著抑制（图7E）。IHC分析显示
，ES+Cu（20 nM, 1:1, 2 h脉冲）处理后
，Ki67染色显著减弱
，表明ES+Cu显著抑制了LCOs的增殖（图7F）。Western印迹和qRT-PCR显示
，KRAS G12D突变可显著激活LCOs中的KRAS信号
，下调OSTM1表达
，并上调ATP7A表达（图7G-H）。通过检测LCOs活力
，作者发现激活KRAS G12D突变后
，LCOs对ES+Cu处理的IC??显著降低
，表明KRAS G12D突变可使LCOs对ES+Cu处理敏感（图7I）。此外
，ES+Cu脉冲可激活内质网应激
，上调OSTM1表达并介导ATP7A降解（图7J-K）。总之
，这些结果表明了ES+Cu通过调控ERS/OSTM1/ATP7A轴对LCOs的治疗作用。

图7 LCOs模型证实KRAS突变状态可以影响LUAD对ES+Cu处理的响应性

9.针对ERS-OSTM1-ATP7A调控轴的挽救实验

为了探究ES+Cu处理引起OSTM1表达增加的内在机制
，作者进行了RNA测序数据富集分析、TCGA数据库分析、qRT-PCR实验、GEO数据库转录组数据分析及相关性分析
，结果表明ES介导的内质网应激可能是OSTM1上调的重要原因。为验证内质网应激在下游调控关系中的作用
，作者使用内质网应激抑制剂（4-PBA）发现ES+Cu脉冲介导的OSTM1上调和ATP7A下调可被4-PBA逆转（图8A）。此外
，添加4-PBA后
，A549细胞也对ES+Cu处理表现出耐受性（图8B）。作者进一步构建了Ostm1敲除LCO模型（图8C）。在LCO模型中
，敲除Ostm1使细胞耐受ES+Cu处理
，表明ES+Cu通过Ostm1发挥关键的下游细胞毒性效应（图8D）。在A549和H358细胞中敲除OSTM1导致ATP7A表达水平升高
，表明OSTM1对ATP7A表达有抑制作用（图8E）。与LCOs中的结果一致
，敲除OSTM1使细胞耐受ES+Cu处理（图8F）
，进一步证实ES+Cu通过OSTM1发挥关键的下游细胞毒性效应。最后
，作者建立了ATP7A敲除细胞模型
，观察到随着ATP7A敲除
，细胞变得耐受ES+Cu处理
，表明ATP7A是ES介导杀伤肺腺癌细胞的重要中间因子（图8G-H）。上述结果证实了ES+Cu通过激活内质网应激上调OSTM1以介导ATP7A降解的调控关系。

为探究KRAS突变、OSTM1表达和ATP7A表达之间的相关性
，作者利用肺腺癌组织芯片阐明其内部调控机制。IHC分析显示：与野生型相比
，KRAS G12突变肺腺癌组织中OSTM1蛋白表达受到抑制
，这可能是KRAS G12突变肺腺癌组织中ATP7A蛋白上调的原因（图8I-J）。进一步的转录组分析结果显示：突变型肺腺癌患者组织中OSTM1 mRNA的表达水平显著低于KRAS G12野生型患者组织。随后作者在敲低KRAS的稳定株中发现OSTM1 mRNA表达量显著高于对照组；过表达KRAS G12的细胞株中发现OSTM1的蛋白和mRNA表达受到抑制；与KRAS G12D未激活的小鼠相比
，在激活了KRAS G12D突变的CC10-rtTA/TetO-Cre/LSL-KRAS G12D条件性突变小鼠中
， OSTM1 mRNA表达显著抑制
，而ES+Cu处理逆转了此抑制效应。总之
，这些结果揭示了在KRAS G12突变肺腺癌细胞中调控OSTM1表达的另一种潜在机制。

图8 ES+Cu通过激活ERS上调OSTM1并降解ATP7A

·全文总结·

本研究系统揭示了铜离子载体elesclomol（ES）联合铜（Cu）靶向治疗KRAS G12突变肺腺癌的全新作用机制：ES+Cu通过诱发内质网应激（ERS）→上调E3泛素连接酶OSTM1→OSTM1特异性识别并介导铜输出蛋白ATP7A发生泛素化降解→破坏细胞内铜代谢平衡 → 导致铜离子异； → 诱导铜死亡。研究利用KRAS-G12D转基因小鼠模型和肺癌类器官模型
，验证了ES及铜联用的体内抗肿瘤效果
，为临床转化提供了临床前证据。并且绕过了直接抑制KRAS蛋白的难题
，通过攻击其下游代谢弱点
，为克服现有KRAS G12C抑制剂低应答率与耐药性提供了全新策略。